År 1938 vädjar en konstsamlare till den framstående arkeologen Dr. Indiana Jones att ge sig ut på ett sökande efter den heliga gralen. Indy får reda på att en medeltida historiker har försvunnit när han letade efter den, och den försvunne mannen är hans egen far, Dr. Henry Jones Sr.. Han ger sig ut för att rädda sin far genom att följa ledtrådar i den gamle mannens anteckningsbok, som hans far hade skickat med posten. till honom innan han försvann. Indy anländer till Venedig, där han tar hjälp av en vacker akademiker, Dr Elsa Schneider, tillsammans med Marcus Brody och Sallah. Tillsammans måste de stoppa nazisterna från att återvinna kraften i det eviga livet och ta över världen!